بررسي پاسخ سالمونلا و اشرشياكلي O157 به انرژي اشعة ماورا بنفش

خلاصه

براي تعيين تاثير اشعة ماوراء بنفش با طول موج 253.7 نانومتر (اشعة UMC) بر روي رشد ميكروب ها ، از پليت هاي تريپتيك سوي آگار به همراه ppm50 (قسمت در ميليون) اسيد ناليديكسليك استفاده نموده ، مخلوط 5 سويه از سالمونلا و اشرشياكلي O157:H7) را در اين محيط تلقيح مي كنيم تا از اين طريق تاثير امواج ماوراء بنفش بر روي اين باكتريها را بررسي نماييم . پيش از تلقيح اين باكتريها در محيط كشت ، غلظت و ميزان باكتريهايي كه تلقيح خواهند شد مشخص مي شود . رقت هاي متوالي تهيه شده و از هر كدام از اين دو عامل بيماريزا ، رقت هاي 100 تا 108 CFU/ml تلقيح مي شوند . دوزهاي متفاوت اشعة ماوراء بنفش ، از 5/1 تا 30 mW/cm2 به غلظت هاي مختلف شيرابه باكتريايي تابانده شد . در تابش اشعه با دوزهاي بيشتر از mW/cm2 4/8 ، از باكتريهاي اشرشياكلي O157:H7 به ميزان 5 لگاريتم كاسته خواهد شد ؛ در حالي كه هنگامي مي توان از سالمونلاها به ميزان 5 لگاريتم كاست كه دوزهاي بالاتر از mW/cm2 5/14 به شيرابة باكتريايي تابانده شود . نتايج حاصل از تابش اشعة ماوراء بنفش به هر دو اين ارگانيسم ها ، منحني حياتي را به شكل حلقه هاي پيچيده اي خواهد كرد . در كل ، استفاده از امواج ماوراء بنفش (UVC) در كاستن از بار ميكروبهاي بيماريزا درسطح ژل آگار بسيار مفيد است .

اشعة ماوراء بنفش در طول موج 200 تا 280 نانومتر تحت عنوان اشعة UVC طبقه بندي مي شود . اين طيف اشعة ماوراء بنفش ، بر روي باكتريها و ميكروبها اثر ميكروب كشي دارد . استفاده از امواج ماوراء بنفش در اين محدوده طول موج ، در ضد عفوني هوا ، محيط هاي مايع و سطوح درماني مفيد است . موفقيت اشعة ماوراء بنفش در ضد عفوني ، مستلزم داشتن سيستمي است كه بتوان از طريق آن دوز لازم از اشعه را به مواد غذايي و يا به سطوحي كه با مواد غذايي ارتباط دارند رساند . اشعة ماوراء بنفش بطور گسترده اي براي ضد عفوني موادي كه در روند آماده سازي و بسته بندي مواد غذايي درگير هستند استفاده مي شود ؛ ولي استفاده از آن بر روي خود مواد غذايي محدود شده است ؛ شايد دليل اين امر ، كم بودن ميزان نفوذ اين اشعه در مواد غذايي باشد و ديگر اين كه سايه هاي اين امواج و درز و شكاف موجود در مواد غذايي مي تواند باكتريها را در برابر تاثير اشعه محافظت كند . البته تاثير اشعة ماوراء بنفش در ضد عفوني سطوح صاف بيشتر است و دليل آن ، تابش اشعه بطور مستقيم بر روي سطوح و عدم پراكنده شدن اشعه در هنگام تابش است .

باچمن (Bachman) در مقالة خود اعلام مي كند كه حساسيت باكتريهاي مختلف به اشعة ماوراء بنفش متفاوت است . پيش از آن تحقيقات ديگري توسط ساير محققين انجام شده بود كه در آنها دوز اشعة مورد نياز براي غير فعال كردن عوامل بيماريزا مورد بررسي قرار گرفته بود ؛ اما نتايج بدست آمده ، نتايجي پيچيده بودند . كوئو (Kuo) و همكارانش در بررسي حود اعلام كردند كه پس از تابش امواج ماوراء بنفش با دوز بيشتر از mw/cm2 30 ، به سالمونلا تيفي موريوم در محيط بريليانت گرين ، از تعداد باكتريها به ميزان 6 لوگ كاسته مي شود . يوسف و مارت (Yousef & Marth) نيز اعلام كردند كه در تابش اشعة ماوراء بنفش با دوز بالاتر از mw/cm2 9 به ليستريا مونوسيتوژن كه بر روي محيط تريپتوز آگار كشت داده شده بود ، تعداد باكتريها به ميزان 3 لوگ كاسته مي شود و در صورتي كه دوز اشعه از mw/cm2 36 بالاتر رود ، از تعداد باكتريها به ميزان 7 لوگ كاسته خواهد شد . سامنر و همكارانش (Sumner et al) نيز اعلام كردند كه در تابش اشعة ماوراء بنفش با دوز mw/cm2 1/3 به محيط Brain Heart Infusion كه سالمونلا تيفي موريوم مقاوم به ناليكساليك اسيد بر روي آن كشت شده بود ، از تعداد باكتريها به ميزان 7 لوگ كاسته مي شود . وونگ و همكارانش (Wong et al) نيز اعلام كردند كه در تابش اشعه با دوز بالاتر از mw/cm2 12 به اشرشياكلي روي محيط تريپتيك سوي آگار ، از تعداد باكتريها به ميزان 5 لوگ كاسته خواهد شد .

تحقيقات سامنر و همكارانش بر روي تابش اشعة ماوراء بنفش به اشرشياكلي O157 : H7 ، تفاوت هاي مشخصي را بين سه سوية اين باكتري نشان مي دهد . در اين بررسي ، حساسترين سويه ، سوية CCUG29199 است كه پس از تابش اشعه به ميزان J/m2 12 ، از تعداد باكتريها به ميزان 6 لوگ كاسته خواهد شد ؛ در حالي كه در مورد مقاومترين سويه يعني CCUG29193 ، براي اين كه 4 لوگ از تعداد باكتريها كم كنيم ، بايد از دوز هاي بيشتر از J/m2 50 استفاده كنيم . اطلاعات بدست آمده از تحقيقات سامنر و همكارانش نشان مي دهد كه در تعيين يك دوز مشخص براي كاستن مقدار معيني از عوامل بيماريزا ، مطالعه بر روي يك گونه كافي نخواهد بود . در سپتامبر 1997، اعلام شد كه ليستريا مونوسيتوژن و اشرشيا كلي O157 : H7 ، از مهمترين عوامل بيماريزا ستند و توصيه شد كه به ازاي هر كدام از اين عوامل بيماريزا ، 5سويه از آنها كه در شيوع و بيماريزايي نقش دارند ، مورد آزمايش قرار گيرند . با توجه به اين مطالعات و نتايج حاصل از آنها ، هدف از اين مقاله ، تعيين ميزان دوز اشعه ماوراء بنفش جهت كاهش مقدار مشخصي از باكتريها ، در سويه هاي مختلف اشرشياكلي O157 : H7 و سالمونلا مي باشد .

مواد و روش ها

آماده سازي براي تلقيح

از هر دو باكتري سالمونلا و اشرشياكلي O157 : H7 ، 5 سويه در اين مقاله مورد بررسي قرار مي گيرند . اين 5 سوية سالمونلا و 5 سوية اشرشياكلي O157 : H7 ، وسيه هايي هستند كه در آلودگي هاي سبزيجات تازه و آبميوه هاي پاستوريزه نشده شايع هستند . باكتري هاي اشرشياكلي O157 : H7 كه در اين مطالعه مورد بررسي قرار مي گيرند عبارتند از :

• اشرشيا كلي سويه H 1730 : كه در يك مورد شيوع آلودگي از طريق كاهو جدا شده است .

• اشرشيا كلي O157 : H7 سويه F4546 كه در آلودگي جوانة يونجه نقش داشته است .

• اشرشياكلي O157 : H7 سويه E0019 كه در شيوع آلودگي در گوشن گاوهاي پرواري نقش داشته است .

• اشرشياكلي O157 : H7 سويه 994 كه در يك مورد آلودگي كالباس خوك (Salami) نقش داشته است .

سالمونلاهاي مورد بررسي در اين تحقيق عبارتند از :

• سالمونلا Montevideo كه در يك مورد آلودگي گوجه فرنگي نقش داشته است .

• سالمونلا Agona كه از آلودگي جوانه يونجه جدا شده است .

• سالمونلا Bailon كه در آلودگي هاي آبميوه و گوجه فرنگي نقش داشته است .

• سالمونلا Michigan كه در يك مورد آلودگي طالبي نقش داشته است .

• سالمونلا Gaminara كه در آلودگي آب پرتقال نقش داشته است .

تمام نمونه هاي مورد بررسي ، به ppm 50 ناليكساليك اسيد مقاوم بودند .

كشت هاي مورد استفاده ، در دماي 80- درجه در آبگوشت تريپتيك سوي براس(Tryptic soy Broth) و همراه با ppm 50 ناليكساليك اسيد نگهداري مي شدند . اين كشت ها در دماي 35 درجه و در TSB رشد كرده و پيش از اين كه به عنوان بذر مورد استفاده قرار گيرند ، 3 بار و با فواصل 24 ساعته به محيط هاي كشت منتقل شدند تا در نهايت بعنوان بذر استفاده شوند . كشت باكتري به مدت 24 ساعت ، به ما اجازه خواهد داد تا باكتري مورد نظر به فاز ساكن رشد ، در غلظت CFU/ml 108 برسد . سپس از هر سويه قسمت هاي مساوي تهيه شده و اين قسمت ها ، در شرايط غير عفوني با مايع رقيق سازي تركيب شده ، شيرابه اي 5 سويه را ايجاد مي كنند . سپس از اين شيرابه ، رقت هاي متوالي (serial dilution) تهيه مي كنيم و پس از 24 ساعت آنها را مورد شمارش قرار مي دهيم تا غلظت هر شيرابه (بذر) را تعيين كنيم .

تلقيح در پليت

شيرابه يا همان بذرها ، با استفاده از 9 ميلي ليتر پپتون %1 استريل بطور متوالي رقيق مي شوند . سپس به ازا هر رقت از دو پليت مسطح TSA كه همراه با ناليكساليك اسيد مي باشد ، براي تلقيح استفاده مي كنيم (رقت ها از 1-10 تا 8-10 هستند) . رقت هاي متعدد مورد آزمايش قرار مي گيرند تا كاهش لگاريتمي قابل سنجش بدست آيد . بذرهاي با درجات بالاتر ، به اين منظور به كار مي روند تا مشخص كنيم كه آيا كاستن از تعداد ارگانيسم هدف به ميزان 5 لوگ عملي است يا خير . استفاده از پليت هاي مسطح ، به اين دليل است كه بتوانيم حداكثر غلظت مكن از باكتريها را در سطح آگار داشته باشيم . پس از تلقيح ، اجازه مي دهيم تا پليت ها به مدت 30 دقيقه در هود خشك شوند تا پس از آن ، تحت تابش قرار گيرند .

مخزن تابش اشعه

اين مخزن حدودا ً يك متر ارتفاع دارد و امواج ماوراء بنفش با طول موج 7/253 را از خود ساطع مي كند . اين مخزن اشعه باعث مي شود تا در فاصلة يك متري ، mw/s/cm2 100 انرژي به سطح وارد شود . مخزن اشعه بر روي يك زنجير قرار دارد و مي توان شدت اشعه را كم يا زياد نمود . شدت اشعه ، با فاصله بين منبع اشعه و هدف ، رابطة معكوس دارد . لذا هرچه منبع اشعه به منبع نزديكتر شود ، شدت اشعه افزايش خواهد يافت . قسمت داخلي اين مخزن ، با يك ماده منعكس كننده قوي پوشيده شده است (solar bright , fuller ultraviolent) . هدف از طراحي اين لايه ، افزايش شدت اشعه و جلوگيري از ايجاد سايه هاي اشعه است ؛ چرا كه اين سايه ها سبب تشكيل اشكال بي قاعده مي شوند . دسترسي به اين دستگاه ، از طريق يك دريچة لوله دار است . دوز اشعه ماوراء بنفش تابش شونده توسط قسمت مدرج كنترل كننده دوز اشعه تعيين شده و در 7/253 نانومتر تنظيم مي شود . اين قسمت كنترل كننده مدرج بوده و پيش از انجام كار ، توسط سازنده استاندارد و تعريف شده است .

تابش اشعه

پليت هاي تلقيح شده ، بطور تصادفي انتخاب شده و هر كدام بطور تصادفي در معرض دوزهاي مختلف اشعه قرار گرفتند . پيش از تابش اشعه ، قدرت اشعه با اندازه گيري ميزان اشعه خروجي مشخص مي شود (بر حسب mw/s/cm2) ؛ و از اين طريق ميزان دوز اشعه دريافتي توسط فرمول D=LT محاسبه مي شود كه در اين فرمول ، D عبارتست از ميزان دوز دريافتي ، L عبارتست از ميزان اشعه (بر حسب mw/s/cm2) و T ، نمايانگر مدت زمان تابش اشعه (بر حسب ثانيه) است . در اين مطالعه ، شدت اشعه ثابت است ولي زمانهاي تابش تغيير مي يابند تا از اين طريق اجازه دهيم (پليت هاي آگار كه باكتريها در آنها كشت داده شده اند ، در معرض دوزهاي مختلف اشعه (از 5/1 تا mw/s/cm2 30) قرار گيرند . زمانهاي تابش از 5 تا 75 ثانيه متغير هستند و اين زمانها توسط يك زمان سنج آزمايشگاهي كنترل مي شود . در طول آزمايش ، شدت اشعه چندين بار اندازه گيري مي شود تا از ثابت بودن خروجي اشعه مطمئن شويم .

شمارش

پليت هايي كه تحت اشعه ماوراء بنفش قرار گرفته اند ، به مدت 24 ساعت در درجه حرارت 35 درجه قرار مي گيرند . سپس كلوني هايي را به شكل تصادفي انتخاب كرده و پيش از آزمايش ، مورد تاييد قرار مي دهيم . تاييد سالمونلاها ، با استفاده از زايلوززيلين داكسي كلران آگار و آزمايش API20E انجام مي شود و تاييد اشرشياكلي O157H7 ، با استفاده از محيط سوربيتول مك كانكي و Immunopercipitate قابل انجام است .

تجزيه آماري

به ازاي هر دوز اشعه كه مورد آزمايش قرار گرفت ، آزمايش هاي انجام شده ، بر روي رقت هاي مختلف بيش از 10 بار تكرار مي شوند . اطلاعاتي كه پ از اين مراحل بدست خواهد آمد ، درجات متوسط ترميم را در پليت هاي اشعه ديده مشخص مي كنند كه البته با درجات متوسطي از خطا نيز همراه خواهد بود . خطاهاي متوسط و استاندارد نيز محاسبه خواهند شد . اطلاعات مربوط به باكتريهاي زنده مانده ، توسط قانون Chick (Ns/N0 g10) مورد سنجش قرار مي گيرند كه در اين فرمول ، Ns عبارتست از چگالي باكتريهاي زنده مانده و N0 غلظت اوليه باكتريها است كه در واقع همان غلظت بذرهاي تلقيح شوند است .

نتايج و بحث در مورد آنها

استفاده از اشعة ماوراء بنفش در سطح TSAN در كاهش جمعيت سرووارهاي سالمونلا و اشرشياكلي O157H7 موثر است . غلظت شيرابه سالمونلا در هنگام تلقيح ، 109×6/2 CFU/ml بوده است و غلظت شيرابه اشرشياكلي O157H7 در هنگام تلقيح 109×0/2 CFU/ml بوده است . شكل زير نشان دهنده ميزان كاهش لگاريتمي سالمونلا و اشرشياكلي O157H7 در سطح TSAN است .