غير فعال سازي با اشعه ماوراء بنفش ، ترميم در محيط مايع و فعالسازي مجدد با اشعه
در مورد اشرشياكلي O157H7 و ديگر سويه هاي بيماريزاي اين باكتري در آب

خلاصه

آب آشاميدني ، آب مورد استفاده در توليد و آبياري ، آب مورد استفاده در پرورش ماهي ، فاضلاب ، آبهاي سطحي و آب استخرها ، اخيرا ً به عنوان حامل انتقال اشرشياكلي بيماريزا (بخصوص سروتيپ O157H7) معرفي شده اند . در اين تحقيق ، ما به بررسي روند غيرفعال سازي با اشعه ماوراء بنفش (در طول موج 7/253 نانومتر) و توانايي ترميم در تاريكي (ترميم در محيط مايع) و فعالسازي مجدد با اشعه ، در مورد 7 عامل بيماريزا (شامل 3 سويه اشرشياكلي انترهموراژيك) و يك سويه اشرشياكلي غيربيماريزا (ATCC12229) و رابطه آنها با استفاده از اشعه ماوراء بنفش جهت ضد عفوني آب مي پردازيم .

بدليل اين كه بسياري از باكتريها ، مخمرها و قارچها قادرند تاثيرات ناشي از امواج ماوراء بنفش بر اسيدهاي نوكلئيك شان را ترميم كنند ، بايستي به مكانيزم هاي ترميم توجه كاملي شود تا در هنگام ضد عفوني آب ، از ايمن بودن و ضد عفوني آب مطمئن شويم . در بين حساسيت سويه هاي مورد بررسي در اي مطالعه به اشعه ماوراء بنفش ، تنوع بسيار زيادي وجود دارد . در پي استفاده از اشعه ماوراء بنفش با قدرت J/m2 12 ، به ميزان 6 لوگ از تعداد اشرشياكلي O157H7 كاسته مي شود كه اين مقدار از كاهش باكتري ، براي ضدعفوني آب كافي است . در حالي كه در اغلب سويه هاي مقاوم (مانند O25:K98:NM براي رسيدن به اين مقصود ، به J/m2 125 انرژي نياز است . به استثناي يك سويه (O50H7) ، ترميم در محيط مايع ، نقش مهمي را در التيام باكتريها پ از تابش اشعه ماوراء بنفش ندارد . در مقابل ، تمام سويه ها بخصوص سويه هاي O25:K98H12 و O157H7 (CCUG29193) ترميم در نور را از خود نشان مي دهند . براي اين كه در مورد اين سويه ها ، تعداد باكتري ها را به ميزان 6 لوگ كاهش دهيم ، بايد شدت اشعه J/m2 300 و طول موج آن 7/253 نانومتر باد . نتايج بدست آمده نشان مي دهد كه شدت اشعه به ميزان J/m2 400 براي ضد عفوني اشرشياكلي بيماريزا كافي است . در مقابل ، استفاده از اشعه با شدت J/m2 160 يا J/m2 250 براي اين منظور كافي نخواهد بود .

ــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــ

آسيب هايي كه تا به حال از باكتري هاي اشرشياكلي بيماريزا به بهداشت عمومي وارد شده ، سبب شده تا امروز توجه ويژه اي به اين باكتري شود و سبب شده تا سويه هاي آنتروهموراژيك اشرشياكلي ، بخصوص سروتيپ O157H7 بعنوان يكي از مهمترين عوامل تهديد كننده سلامت انسان شناخته شوند . ديگر سويه هاي اشرشياكلي بيماريزا عبارتند از : اشرشياكلي هاي Entroinvasive (تهاجمي به روزه) ، اشرشياكلي هاي بيماريزاي روده (Entropathogenic) و اشرشياكلي مسموميت زاي روده (Entrotoxemic) . تفاوت بين اين سه سويه اشرشياكلي ، بر اساس سه آنتي ژن سطحي مهم است : O (سوماتيك) ، F (فلاژل) و K (كپسولار) ؛ و انتقال اين باكتريها ، در پي آب و غذا ايجاد مي شود . در اين رابطه ، آب آشاميدني ، آب مورد استفاده در تهيه مواد غذايي ، آب مورد استفاده در آبياري ، آب مورد استفاده در پرورش ماهي ، آب هاي دفعي و آب استخرها اخيرا ً به عنوان حاملين مهم اين ميكروارگانيسم هاي بيماريزا شناخته شده اند . مطالعات اخير نشان مي دهد كه اشرشياكلي O157H7 ، يك عامل شديدا ً بيماريزا است كه مي تواند مدت زيادي ، و معمولا ً بيش از 91 روز در آب (بخصوص در دماهاي پايين) زنده بماند . لذا آب مصرفي انسان بايد با توجه به سرچشمة آن و كيفيت بهداشتي آب مورد ضد عفوني قرار گيرد . براي ضد عفوني كردن آب ، تابش اشعة ماوراء بنفش يمي از روشهاي بسيار جالب است كه از روش هاي شيميايي مانند استفاده از كلر و ازن بسيار موثرتر است و از آن هم در مورد آب مصرفي انسان و هم در مورد فاضلاب استفاده مي شود . براي مطمئن شدن از آب ضد عفوني شده ، بايستي اطلاعات دقيق و كاملي در مورد چگونگي غيرفعال شدن عوامل بيماريزاي آب در اين روش بدست آوريم .

ضد عفوني كردن آب بوسيله كلر ، توسط دو گروه مورد بررسي قرار گرفته است و هر دو گروه اعلام كردند كه با استفاده از كلر جهت ضد عفوني آب ، هيچ تفاوتي در مقاومت اشرشياكلي بيماريزا و غير بيماريزا وجود ندارد و نتيجه گرفتند كه در شرايط طبيعي ، ضد عفوني آب آشاميدني به اين روش قادر است تا اشرشياكلي هاي بمياريزا را غيرفعال كند .

اما در مورد ضدعفوني با استفاده از اشعة ماوراء بنفش ، تا به حال تنها نتايج تحقيقات يك گروه ، بر روي اشرشياكلي بيماريزا اعلام و منتشر شده است . غير فعال سازي ميكروارگانيسم ها با استفاده از اشعة ماوراء بنفش ، در پي آسيب هاي ايجاد شده در اسيدهاي نوكلئيك ايجاد مي شود . امروزه مي دانيم كه باكتريها و مخمرهاي متعددي وجود دارند كه آنزيم هايي دارند كه قادر است آسيب هاي ايجاد شده روي اسيد هاي نوكلئيك را ترميم كنند . اين آنزيم ها در مسير ترميم در تاريكي نقش دارند ؛ مانند ترميم در محيط مايع (بخصوص آنزيمي كه كار شكافتن اسيدهاي نوكلئيك را بر عهده دارد) و فعال سازي مجدد نوري پس از تايش نور (با آنزيم فتولياز) . تاثير ترميم در تاريكي ، ابتدا توسط رابرت و آلدوس (Robert و Aldoos) و در سال 1949 معرفي شد . در اين بررسي ، مشخص شد كه باكتريهايي كه تحت تاثير اشعه ماوراء بنفش در باكتريهايي كه تحت تاثير اشعه ماوراء بنفش قرار گرفته بودند ، اگر پيش از تابش اشعه ، باكتريها را چند ساعت در يك بافر عاري از مواد غذايي قرار دهيم ، قدرت حياتي آنها افزايش خواهد يافت . اين تاثير توسط محققين در اشرشياكلي B مشاهده شد و به دليل پاسخ ترميمي باكتري در محيط مايع ، بسيار مورد توجه قرار گرفت .

فعالسازي مجدد نوري ، يك مكانيزم بسيار قوي است كه توسط آنزيم فتولياز صورت مي گيرد . اين آنزيم بايد توسط انرژي نور ، در محدودة طيف آبي - بنفش فعال شود . در ضد عفوني آب آشاميدني ، اين روند ترميم وابسته به نور ، نقش مهمي را ايفا نمي كند ؛ چرا كه آب آشاميدني معمولا ً در شرايط تاريك كنتقل شده و در مخازن ذخيره مي شود . اما فاضلاب ها و آب مورد استفاده در آبياري و پرورش ماهي ، بلافاصله پس از ضد عفوني با اشعه ماوراء بنفش در معرض نور مرئي قرار مي گيرند . از اينرو بايد به روند ترميم در نور ، بخصوص در مورد ميكروارگانيسم هايي كه سلامت عمومي را تهديد مي كنند كاملا ً توجه كنيم تا از ايجاد شرايطي مناسب براي ضدعفوني آب مطمئن شويم .

با توجه به مطالعات قبلي ، از سال 1993 در اتريش ، از روش ضدعفوني آب بوسيلة امواج ماوراء بنفش استفاده شد و جزئيات ايم كار بطور دقيق مشخص شد و اخيرا ً نيز اين كار در آلمان در حال انجام است . در اين روش ها ، مهمترين قسمت ، اندازه گيري دوز اشعه است و اين ميزان بايد حداقل J/m2 400 بوده و به روش بيودوزيمتري اندازه گيري شده باشد . لذا هدف از بررسي ما ، در درجه اول تعيين چگونگي غيرفعال شدن سوي هاي بيماريزاي اشرشياكلي توسط اشعه ماوراء بنفش (با طول موج 7/253) و در درجه دوم ، اين است كه تعيين كنيم كه آيا اين سويه ها داراي فعاليت ترميم در تاريكي و فعالسازي مجدد نوري هستند يا خير . سوم اين كه تعيين كنيم كه آيا اين ميزان اشعه (J/m2 400) براي براي اين كه باكتري را در آب آشاميدني بطور كامل غير فعال كنيم كافي است يا خير ؛ و در ضمن ترميم وابسته به نور و ترميم در محيط مايع را نيز در نظر داشته باشيم .

مواد و روش ها

در مطالعات ما ، 7 عامل بيماريزاي زير مورد بررسي قرار مي گيرند :

1 - اشرشياكلي O157:H7 (CCU29197) كه در يك مورد شيوع عفونت همبرگر در انگليس گزارش شده است .

2 - اشرشياكلي O157:H7 (CCUG29199) كه از يك مورد سندرم هموليتيك اورميك در كاروليناي شمالي جدا شده است .

3 - اشرشياكلي O50:H7 (CCUG29198) كه از يك بيمار مبتلا به التهاب خونريزي دهنده كلون جدا شده است .

4 - اشرشياكلي O50:H7 (CCUG29193) كه از مدفوع انسان جدا شده است .

5 - اشرشياكلي O78:H11 (ATCC35401) كه از مدفوع انسان جدا شده است .

6 - اشرشياكلي O25:K98:H12 (ATCC43886) كه درشيوع بيماري در انسان و در كشتي جدا شده است .

7 - اشرشياكلي O25:K80:H12 (ATCC43896) كه از اسهال كودكان جدا شده است .

براي مقايسه نتايج ، يك سويه اشرشياكلي غير بيماريزا (سويه ATCC1229) كه معمولا ً در مطالعات بر روي مواد ضد عفوني مورد بررسي قرار مي گيرد نيز تحت آزمايش قرار مي گيرد .

كشت و شمارش ارگانيسم هاي مورد آزمايش

سويه هاي اشرشياكلي مورد بررسي ، روي محيط كشت كلمبيا آگار ، و به مدت 24 ساعت در حرارت 37 درجه تحت كشت قرار گرفتند . سپس سلولها با دقت به سطح آگار منتقل شده و در سطح محلول استريل %9/0 نمك مي شوند و در انتها آنها را با استفاده از يك مخلوط كن ، هموژن مي كنيم . سپس سوسپانسيون بدست آمده را با استفاده از يك منحني درجه بندي شده ، در غلظت هاي 106 تا 107 CFU/ml رقيق كرده و در مقابل دانسيته نوري 578 نانومتر قرار مي دهيم .

در مرحله مقدماتي ، هيچ تفاوت مشخصي در غير فعال شدن سويه هاي باكتري مشاهده نمي شود . در صورتي كه سلولها در اين شرايط و يا در محيط مايع (تريپتوز سوي آگار ؛ اكسيد) رشد كردند ، آنها را تحت سانتريفوژ و سپس شستشو قرار مي دهيم . در مرحله بعد براي كشت باكتريها از روشي بايد استفاده كنيم كه كمترين زمان ممكن براي آن صرف شود .

در مشاهدات ميكروسكوپي مشخص شد كه هيچ تراكم باكتريايي در سوسپانسيون مشاهده نمي شود . شمارش باكتريها (بصورت CFU/ml) پيش و بعد از تابش اشعه و فعال سازي مجدد نوري انجام مي گيرد كه اين كار را در پي كشت متراكم در سطح آگار شمارش (plate count agar) و سپس انكوباسيون به مدت 24 ساعت در دماي 37 درجه انجام مي دهيم .

تابش اشعه ماوراء بنفش در آزمايشگاه

در اين بررسي ، از يك منبع با 10 لامپ ماوراء بنفش كم فشار جيوه استفاده مي كنيم و اين لامپ ها را بطور افقي روي پليت ها قرار مي دهيم . نموداري نيز بطور ثابت ، زير لامپ هاي UV قرار مي گيرد و در ضمن شدت اشعه نيز بوسيلة يك مبدل تنظيم مي شود . سوسپانسيون هاي مورد آزمايش (25 ميلي ليتر) كه در پليت هاي استريل با 90 ميلي متر قطر قرار دارند را تحت تابش اشعه قرار مي دهيم . عمق لايه ، 4 ميلي متر است . طول موج اشعه نيز بطور همزمان توسط يك راديومتر اندازه گيري شده و به اشعه منعكس شده نيز توجه مي كنيم . تمامي اين مراحل آزمايش در حرارت اتاق انجام مي گيرد .

فعالسازي مجدد بواسطه نور در وسايل آزمايشگاهي

مقادير مساوي از 5 ميل ليتر از ارگانيسم هاي اشعه ديده را در پليت هاي استريل (با 60 ميلي متر قطر) زير 5 لامپ ثابت روشن فلورسنت با طول موج 360 تا 700 نانومتر قرار مي دهيم . فاصله بين سطح سوسپانسيون موردآزمايش ، 60 ميلي متر است . شدت نور بطور همزمان توسط يك راديومتر اندازه گيري مي شود . مقدار متوسط نور كه در اين قسمت تابيده مي شود ، x1 23500 مي باشد كه با شدت نور در سايه يك روز تابستاني در اروپاي مركزي برابر است . براي يهينه سازي زمان فعالسازي مجدد نوري ، از سوسپانسيون هايي استفاده مي كنيم كه اشعه ماوراء بنفش را به ميزان J/m280 دريافت كرده و به مدت 30 ، 60 ، 90 و 120دققه آنها را در معرض تابش نور قرار مي دهيم . در هر مطالعه ، يك نمونه كه تحت تابش اشعه ماوراء بنفش نبوده ، بعنوان نمونه كنترل ، تحت تابش نور قرار مي گيرد . اين آزمايش ها نيز در دماي اتاق انجام مي گيرند .

ترميم در محيط مايع

مقادير مساوي 5/0 ميلي ليتر از سوسپانسيون اشعه ديده مورد آزمايش را به 5/4 ميلي ليتر محلول بافر اضافه كرده و بمدت 48 ساعت در دماي 22 درجه در محيط تاريك كشت مي دهيم . تركيب اين بافر كه Harm نام دارد عبارتست از :

- 7 گرم Na2HPO4 . 12H2O
- 3 گرم KH2PO4
- 4 گرم NACL

اين تركيبات را در 1000 ميلي ليتر آب ديونيزه (آب مقطر) حل مي كنيم و 4 ميلي ليتر MgSo4 نيم مولار استريل را نيز به اين بافر اضافخ مي كنيم . در هر آزمايش ، يك نمونه كه تحت تابش ماوراء بنفش نبوده ، بعنوان نمونه كنترل در نظر گرفته مي شود . در ابتدا دو بافر دگر نيز مورد آزمايش قرار گرفتند (نمك % 9/0 و نمك با بافر فسفات) . اما هر دو اين بافرها ، در مقايسه با حالت قبلي ترميم كمتري را ايجاد مي كنند . لذا تمام مطالعات ما با استفاده از بافر قبلي (بافر Harm) انجام مي گيرد .

تجزيه آماري

تمام آزمايش ها را سه مرتبه ديگر تكرار كرده و نتايج حاصله را با در نظر گرفتن انحراف معيار ثبت مي كنيم . غلظت هاي نمونه هايي كه اشعه نديده اند (N0) و نمونه هايي كه تحت تابش اشعه قرار گرفته اند (N) به ارزش هاي log10 تبديل شده و ميزان كاهش باكتريها مورد محاسبه قرار مي گيرد . مقادير كمتر از محدوده ، با عنوان

براي توصيف منحني هاي غيرفعالسازي باكتري ، مقادير منحني بصورت K (شيب منحني بر اساس m2/J) و d (پهنا) ، به صورت زير محاسبه مي شوند :

N/N0=1-(1-10-KH0)d

كه در اين فرمول H0 نشان دهنده شدت موج (بر اساس J/m2) است . با بالا رفتن پارامتر K و پايين آمدن d ، حساسيت ميكروارگانيسم بالا مي رود . پارامتر d ، نشان دهنده توانايي باكتري در ترميم آسيب وارده است .

نتايج

غيرفعالسازي با استفاده از اشعه ماوراء بنفش

ميزان غيرفعال شدن 8 سويه اشرشياكلي در اين روش ، بطور قابل ملاحظه اي متفاوت است . در مورد سوية بسيار حساس يعني O157:H7 (CCUG29199) ، در شدت اشعه به ميزان J/m2 12 ، 10 لوگ از تعدادا باكتريها كاسته مي شود ؛ در حالي كه در مورد سويه هاي مقاوم مانند O25:K8:NM ، به J/m2 125 انرژي نياز است . سه سويه سروتيپ O157:H7 به هيچ عنوان نتايج يكساني را در غيرفعال شدن نشان نمي دهند . در جدول زير پارامترهاي منحني نشان داده شده است .

فعالسازي مجدد در نور

بطور كلي ، تاثير فعالسازي مجدد بواسطة نور در ترميم باكتري ، بسيار بيشتر از ترميم در محيط مايع است . البته در اين مورد استثنايي وجود دارد كه اشرشياكلي O50:H7 است كه در اين باكتري هر دوي اين مكانيزم ها تاثير ثابتي در ترميم دارند . تاثير ترميم بواسطة نور در سويه هاي O25:K98:NM ، O78:K80:H12 و O50:H7 (CCUG29193) از همه مهمتر و مشخص تر است . لذا در مورد اين سويه ها ، بايد شدت اشعه ماوراء بنفش به ميزان 2-3 برابر (J/m2 300) بيشتر باشد تا بتوان تعداد اين باكتري ها را پس از فعالسازي مجدد بواسطة نور ، به ميزان 6 لوگ كاهش داد . در اين مورد نيز مقادير منحني در جدول آورده شده است .

در نمونه هاي كنترل (سوسپانسيون هاي سلولي كه اشعه نديده بودند، اما در معرض تابش نور قرار گرفته بودند) ، هيچ كاهش و يا افزايشي در غلظت ارگانيسم هاي مورد آزمايش مشاهده نمي شود .

ترميم در محيط مايع

به استثناي باكتري اشرشياكلي سويه O50:H7 ، در سيار سويه هاي اشرشياكلي ، پس از اين كه باكتريها را به مدت 48 ساعت در شرايط تاريك در معرض اشعة ماوراء بنفش قرار داديم ، ترميم در محيط مايع يا اصلا ً مشاهده نمي شود ؛ و يا اين كه تنها افزايش اندكي در ميزان كلي ترميم ايجاد مي كند . پارامترهاي منحني در اين مورد هم در جدول 1 آورده شده اند . در مورد سويه O50:H7 ، قدرت اشعه ماوراء بنفش ، بايد به ميزان 7/1 برابر بيشتر باشد تا بتواند به ميزان 6 لوگ از تعداد باكتريها كم كند . در سويه O157:H7 ، در پي قرار گرفتن باكتري در بافر ، حتي كمي از قدرت حياتي باكتري كاسته شده ، ترميم در محيط مايع اثر منفي مي يابد .

بحث و بررسي

غيرفعالسازي سويه هاي اشرشياكلي بيماريزا ، تفاوت هاي بيشتري را در مقايسه با اشرشياكلي بيماريزا نشان مي دهد . يكي از سويه هاي مورد بررسي ، سويه O157:H7 است كه فوق العاده حساس بود ؛ و اين امر نشان دهنده قدرت ترميمي پايين اين باكتري است . با توجه به تفاوت هاي مشخصي كه بين حساسيت سه سويه O157:H7 با يكديگر ، مي توان گفت كه هيچ ارتباطي بين سروتيپ و مقاومت وجود ندارد .

در مطالعه ما ، ترميم در محيط مايع ، در مقايسه با فعالسازي مجدد بواسطة نور نقش مهمي را در ترميم ايفا نمي كند . اما در اين مورد يك استثناء هم داريم كه همان سويه O50:H7 است . در مورد سويه هاي غير بيماريزاي سويه ATCC11229 و 6 سويه بيماريزاي ديگر ، هيچ افزايشي را در ميزان ترميم مشاهده نمي كنيم . بطور كلي به نظر مي رسد كه اشرشياكلي سويه B ، جزو گروه كلي اشرشياكلي نيست . اين نتايج با يافته هاي كاشيمادا و همكارانش مطابقت دارد كه به ترميم در تاريكي در سويه هاي K12 و B توجه نكرده بود . البته باكتريهاي ديگر مانند باكتريهاي بيماريزاي ماهي همچون آئروموناس و يرسينيا و ويبريو قادرند صدماتي كه در پي تابش اشعه ماوراء بنفش به آنها وارد مي شود را در محيط مايع ترميم كنند .

اطلاعات ما در مورد اشرشياكلي غير بيماريزا سويه ATCC11229 و ترميم آن پس از 2 ساعت تابش نور (بدون مشخص كردن طول موج اشعه) ، حداكثر ترميم را به ميزان 4/3 و 3 لوگ نشان مي دهد .

در اين مطالعه ، حداكثر ترميم سويه هاي اشرشياكلي پس از تابش نور به مدت 2 ساعت (با شدت 23500) ، كمي افزايش مي يابد . به همين صورت كاشيمادا و همكارانش نيز همين نتيجه را بدست آوردند . اين نتايج نشان مي دهد كه در سويه هاي باكتري اشرشياكلي ، رفتار هر باكتري در فعالسازي مجدد نوري ، با باكتري ديگر متفاوت است .

تا به حال ، تنها تحقيقات منتشر شده در مورد غيرفعالسازي اشرشياكلي ، توسط Tosa و Hirata انجام شده است . اين دو دانشمند توانستند در استفاده از اشعه ماوراء بنفش با شدت J/m2 33 ، تعداد اشرشياكلي O157:H7 را به ميزان 2 لوگ و در شدت J/m2 130 ، تعداد سويه O26 را به ميزان 4 لوگ كاهش دهند . البته در اين بررسي ، روند فعالسازي نوري ، تنها در مورد سويه 26 انجام شد . نتايج اين تحقيقات ، با تحقيقات ما كه در مورد سه سويه O157:H7 انجام شد ، مغايرت دارد ؛ چرا كه در بررسي ما بر روي اين سويه ها ، پس از تابش نور ، ترميم به صورت كم و بيش در ساختار باكتري ديده مي شود . اين مغايرت را مي توان با توجه به تفاوت هاي موجود در ترميم نوري باكتريها توجيه نمود و همچنين اين كه شدت تابش نور در مطالعه Hirata و Tosa ، كمتر از نور روز است .

در طي مطالعات ما مشخص شد كه استفاده از اشعه ماوراء بنفش با طول موج 7/253 نانومتر (J/m2 400) ، براي كاهش 6 لوگ از تعداد اشرشياكلي بيماريزا ، شامل اشرشياكلي انترهموراژيك كافي است . لذا بنظر مي رسد كه ميزان اشعه مورد استفاده در كشورهايي مانند سوئيس (J/m2 250) و نروژ (J/m2 160) براي ضد عفوني آب كافي نيست . به علاوه بايستي توجه داشت كه ميزان اشعه ماوراء بنفشي كه مي خواهيم از آن در ضد عفوني آب براي گياهان استفاده كنيم را نمي توان با انجام محاسبات پيش گويي كرد و بايد آن را با آزمايشات دقيق مشخص نمود .