آزمايش هاي تشخيصي بيماري يون در گاو :

1 - اهميت كلي انجام آزمايش هاي تشخيصي در گاو :

آزمايش هاي تشخيصي بيماري يون ، به عنوان ابزاري هستند كه توليد كنندگان با استفاده از آنها مي توانند به هدف خود كه جلوگيري از ورود بيماري به گله و يا كنترل بيماري در گله مي باشد دست يابند . اما براي دست يابي به هيچ كدام از اين اهداف ، نمي توان از تنها يك آزمايش استفاده كرد . بنابراين براي تشخيص و كنترل بيماري يون ، آزمايش هايي دقيق كه از نظر هزينه نيز به صرفه باشند وجود دارد . انتخاب آزمايش مناسب ، بسته به موقعيت كلينيكي حيوانات مشكوك به آلودگي امري بسيار مهم است و بايد با دقت كافي انجام شود . هنگامي كه مي خواهيم از بين چند آزمايش يكي را انتخاب كنيم ، بايستي موارد زير براي ما مشخص باشند :

روند عفونت در يك حيوان و انتقال آن به حيوانات ديگر گله .
هدف ما از انجام آزمايش .
ارزش اقتصادي حيواني كه آزمايش ها بر روي آن انجام مي گيرد .
دقت هر يك از آزمايش ها كه بر روي يك حيوان و يا يك گله انجام مي شوند .

پي آمد آزمايش هايي كه نتيجه آنها نتيجه مثبت كاذب و يا منفي كاذب است . در حال حاضر ، 9 آزمايش هستند كه بيشتر از بقيه براي تشخيص بيماري يون مورد استفاده قرار مي گيرند . 4 تا از اين آزمايش ها كار ِ جستجوي باكتري عامل بيماري يون را انجام مي دهند ، 4 آزمايش پادتن سرمي را جستجو مي كنند و آزمايش آخري ، ميزان ايمني سلولي را اندازه مي گيرد . 5 تا از اين آزمايش ها ، تست هاي تجاري هستند و براي انجام توسط آزمايشگاه هاي تشخيص دامپزشكي موجود مي باشند .
بيشتر آزمايش هاي تشخيصي بيماري يون ، به امكانات پيشرفته آزمايشگاهي و روش هاي پيشرفته احتياج دارند . در ضمن عواملي مانند ميزان عددي يك آزمايش و همچنين نرخ آلودگي گله ، مي تواند تفسير ما در مورد نتايج آزمايش را دستخوش تغيير كند . بنابراين تفسير نتايج آزمايش هاي تشخيصي بيماري يون ، به فردي با تجربه كافي نيازمند است .
نتيجه منفي يك آزمايش ، بايد با توجه به عامل ايجاد كننده آن ، تاريخچه بيماري يون در گله و همچنين تعداد مورد بررسي تفسير شود . در بسياري از موارد ، پاسخ منفي بدست آمده ، مي تواند يك پاسخ منفي كاذب باشد .
با توجه به اين كه آزمايش هاي تشخيصي به دو صورت آزمايش هاي كشت مدفوع و آزمايش هاي سرولوژيكي هستند ، روش هاي انجام آزمايش نيز مي تواند متفاوت باشد . به همين دليل ، آزمايشگاه ملي بيماري ها ، برنامه آزمايش را در محل كنترل مي كند . اين آزمايشگاه ، با سازمان ملي خدمات دامپزشكي (NVSL) در ارتباط است و به استاندارد نمودن روش هاي آزمايشگاهي و ايجاد آزمايشگاه هايي مجهز كمك مي كند . در حال حاضر ، آزمايش هايي كه به طور معمول براي تشخيص بيماري يون استفاده مي شوند عبارتند از آزمايش كشت مدفوع ، AGID و الايزا (ELISA) . نكته قابل توجه اين است كه حساسيت آزمايش (درصد حيواناتي كه نتيجه آزمايش آنها بطور صحيح مثبت اعلام شده است ) بر حسل مراحل بيماري يون متغير است . در مراحل اوليه ، بيماري ( مرحله اول ) و پيش از اين كه حيوانات شروع به دفع باكتري از مدفوع كنند و يا پاسخ ايمني قابل اندازه گيري داشته باشند ، نتيجه آزمايش تمام حيوانات منفي خواهد بود ، حتي اگر آلوده باشند .
با ورود آلودگي به مرحله 2 و 3 ، آلودگي را با بيشتر آزمايش ها مي توان مشخص كرد . هنگامي آزمايش ها حداكثر حساسيت را دارند ، كه براي حيواناتي استفاده شوند كه علائم كلينيكي بيماري ( مانند اسهال و كاهش وزن كه در انتهاي مرحله 3 و 4 ديده مي شود ) را نشان دهند . با توجه به اين كه هيچ آزمايشي مي تواند بطور دقيق عدم آلودگي را نشان دهد ، استفاده از 2 و يا چند آزمايش و به دنبال هم ، مي تواند اطمينان ما را از نتيجه بدست آمده بيشتر كند .

2 - آزمايش هايي كه به باكتري عامل بيماري يون توجه دارند :

بطور كلي ، چهار روش وجود دارند كه به جستجوي عامل بيماري يون ( مايكوباكتريوم اويوم زير گونه پاراتوبركلوزيس ) مي پردارند . اين چهار روش عبارتند از :

كشت متعارف مدفوع
كشت راديومتريك
جستجوي DNA
آزمايش هاي ميكروسكوپي بافت .

كشت معمول ( متعارف ) مدفوع :

بسياري از آزمايش هاي موجود در دنيا ، مي توانند اين آزمايش را انجام دهند . اين روش به تجهيزات كمي نياز داشته ، از نظر تكنيك كار نيز ساده است . البته اين آزمايش مستلزم داشتن تجربه زياد براي تشخيص كلوني هاي باكتري بر روي محيط كشت است . اين روش ، تقريبا ً گران است و بايد حدودا 16 هفته براي تكميل و انجام آن زمان صرف نمود كه اين امر ، به دليل رشد آهسته باكتري است . حساسيت اين روش در حدود 40 درصد ( 10+ درصد ) است و اختصاصيت آن ، در صورتي كه آزمايش به درستي انجام شود ، در حدود 99 درصد خواهد بود . روش هاي كشت مدفوع ، در صورتي كه حيوان در مرحله 1 يا 2 آلودگي باشد نمي توانند آلوده بودن دام را مشخص كنند و بنابراين بايد پاسخ هاي منفي را با دقت تفسير نمود .

كشت راديومتريك :

اين روش ، بر پايه جستجوي راديو اكتيو (راديوايزوتوپ) عامل بيماري است و با روشي كه در انسان به منظور تشخيص سل استفاده مي شود يكي است . مزيت اين روش اين است كه مي تواند تعداد كم باكتري ها را نيز جستجو كند و سرعت آن نيز از روش كشت متعارف سريعتر است ( 7 هفته كه در مقايسه با 16 هفته زمان بسيار كمتري است ) . مشكلات اين روش عبارتند از گران بودن آن ، نياز به تجهيزان ويژه براي خواندن ويال هاي كشت و سر و كار داشتن ما با ايزوتوپ هاي پرتوافشان ( راديوايزوتوپ ها ) است . روش هاي راديومتريك نيز نمي توانند حيواناتي كه در مرحله اول آلودگي هستند را شناسايي كنند ، اما مراحل انتهايي آلودگي در مرحله 2 با اين روش مشخص مي شود . حساسيت اين روش نيز در حدود 40 درصد و اختصاصيت آن در حدود 99 درصد مي باشد و نتيجه منفي به دست آمده را بايد به دقت تفسير و بررسي نمود .

جستجوي DNA :

اين روش به ما اجازه مي دهد كه ميكروب را بدون كشت آن مورد جستجو قرار دهيم . بنابراين از دو روش قبل بسيار سريعتر مي باشد . اين آزمايش را مي توان در كمتر از سه روز انجام داد ؛ اما مشكل عمده اين روش هزينه بالاي آن است . در اغلب آزمايشگاه ها ، هزينه جستجوي DNA ، دو برابر كشت باكتري هزينه دارد .
اين آزمايش ، قادر به شناسايي حيواناتي كه در مرحله اول و يا دوم آلودگي قرار دارند نيست . در طول مراحل اوليه آلودگي ، زخم هاي ناشي از بيماري يون ، كمتر توسعه يافته ، بيشتر موضعي هستند . بنابراين باكتري بيشتر به تعداد بسيار كمي ديده مي شود . حساسيت اين روش ، به مرحله بيماري و تعداد و نوع نمونه برداشتي وابسته است . اين روش به بافت هاي خاصي نياز دارد كه بايد با رئش هاي سرولوژيك . يا نكروپسي تهيه شده ، پيش از فرستاده شدن به آزمايشگاه ، روند آماده سازي خاصي را سپري كرده باشند كه اين دو مورد نيز باعث بالاتر رفتن هزينه اين روش خواهند شد .

3 - آزمايش هايي كه با پادتن هاي مايكوباكتريوم پاراتوبركلوزيس در خون در ارتباط هستند ( آزمايش هاي خوني ) :

آزمايش هاي سرولوژيك جستجوي پادتن باكتري عامل بيماري يون ( مايكوباكتريوم اويوم زير گونه پاراتوبركلوزيس ) در خون ، در بيشتر آزمايشگاه هاي تشخيصي وجود دارند . اين روش ها عبارتند از

آزمايش AGID
الايزا
آزمايش تثبيت عناصر مكمل (CF) .

همانطور كه گفته شد ، روش هاي آزمايشگاهي متفاوت هستند و آزمايشگاهي كه اين آزمايش ها را انجام مي دهد بايد توسط NVSL تاييد شده باشد . آزمايش AGID در گاوي كه نشانه هاي كلينيكي بيماري را نشان مي دهد ( يعني در انتهاي مرحله 3 و مرحله 4 آلودگي قرار دارد ) ، اختصاصيت بالايي دارد ( حدود 99 درصد ) ؛ اما در گاوهاي آلوده اي كه علائم بيماري هنوز ديده نمي شود ، نتيجه آزمايش AGID كمتر مثبت خواهد بود . حساسيت اين آزمايش ، در گاو هايي كه پيش از مرحله 4 آلودگي به ميكروب عامل بيماري يون آلوده باشند در حدود 30 درصد است و تنها در مراحل پيشرفته بيماري ( كه علائم كلينيكي نيز مشاهده مي شوند) است كه حساسيت اين آزمايش به حساسيت آزمايش الايزا مي رسد . اغلب ، براي آزمايش گله ها از آزمايش الايزا استفاده مي شود . نتايج مثبت آزمايش الايزا در دام هايي ديده مي شود كه تعداد بيشتري از باكتري عامل بيماري يون را از طريق مدفوع دفع مي كنند ( انتهاي مرحله 2 ، مرحله 3 و مرحله 4 آلودگي ) . جستجوي آلودگي با روش الايزا به مرحله بيماري دامي كه مورد بررسي است وابسته مي باشد . در حيواناتي كه علائم كلينيكي بيماري را نشان مي دهند ، حساسيت آزمايش الايزا در حدود 85 درصد است ؛ اما در نمونه هايي كه علائم بيماري مشاهده نمي شود ، اين ميزان تا حدود 15 درصد سقوط مي كند . در حال حاضر ، اين روش با استفاده از كيت هاي تشخيصي الايزا نيز انجام مي شود .

بعضي مواقع ( به ندرت ) ، حيواناتي كه علائم كلينيكي بيماري را نشان مي دهند ، در آزمايش كشت مدفوع و AGID ، پاسخ مثبت دارند ، اما نتيجه آزمايش الايزاي آنها منفي است و تا كنون توضيحي در مورد دليل بروز اين حالت ارائه نشده است .

اكثر متخصصان بيماري يون پيشنهاد مي كنند كه هر گاه علائم بيماري مشاهده نمي شود و حيوان نيز از نظر ژنتيكي با ارزش بوده ، ميزان تخميني پيش از آزمون نيز مشخص نيست ، بايد هر پاسخ مثبت آزمايش الايزا را با يك آزمايش ميكروبيولوژي مانند كشت مدفوع و يا جستجوي DNA همراه كنيم .

مانند ساير روش ها ، در مورد اين آزمايش نيز بايد پاسخ هاي منفي را به حساب مشاهده نشدن عامل بيماري بگذاريم و نه عدم وجود آلودگي . استفاده مهمي كه از آزمايش الايزا مي شود ، در آزمودن گله هاي گاو است . اگر نتيجه آزمايش الايزا در مورد گاو ها منفي باشد و در 5 سال گذشته نيز هيچ نمونه اي از بيماري يون در گله مشاهده نشده باشد ، به احتمال زياد گله مورد بررسي عاري از بيماري يون است . گاو هايي كه عليه بيماري يون واكسينه مي شوند ، در آزمايش الايزا پاسخ مثبت خواهند داشت و مشخص كردن اين كه پاسخ مثبت بدست آمده ، در نتيجه آلودگي به بيماري است و يا واكسيناسيون ، امكان پذير نيست . آزمايش الايزا از آزمايش هايي است كه به منظور مشخص نمودن وضعيت گله هاي گاو در امريكا انجام مي شود و گله هايي كه احتمال آلوده بودن آنها وجود داشته باشد با اين روش شناسايي مي شوند . به منظور تاييد پاسخ هاي مثبت آزمايش الايزا ، از كشت مدفوع استفاده مي شود . آزمايش تثبيت عناصر مكمل كه توسط بيشتر كشور هاي صادر كننده و يا وارد كننده گاو استفاده مي شود ، از نظر حساسيت و اختصاصيت ، بين الايزا و AGID قرار دارد و همواره در آن پاسخ هاي مثبت كاذب و يا منفي كاذب زياد هستند . در ايالات متحده معمولا ًاين روش براي تشخيص بيماري يون به كار نمي رود .

بطور كلي هنگامي كه از آزمايش هاي سرولوژيك به عنوان روشي براي شناسايي گله هاي آلوده استفاده مي كنيم ، اين روش ها دقت بالايي خواهند داشت . هنگامي كه از اين آزمايش ها بر روي تنها يك دام آلوده با علائم كلينيكي استفاده مي كنيم ، پاسخ بدست آمده دقيقتر از حالتي است كه از آن بر روي حيواناتي بدون علائم كلينيكي استفاده نمائيم ( به استثناي حيواناتي كه تعداد زيادي باكتري را از طريق مدفوع خود دفع مي كنند ) . براي افزايش اطمينان از ميزان آلودگي واقعي يك حيوان ، بايد نتيجه آزمايش را در كنار تاريخچه گله و يا شيوع بيماري يون و ميزان نسبت احتمالي و ارزش پيش از آزمون بررسي و تفسير نماييم . براي اطمينان بيشتر در مورد پاسخ هاي مثبت ، پيشنهاد شده كه به دنبال آزمون هاي سرولوژيكي ، از آزمون هاي ميكروبي مانند كشت مدفوع و جستجوي DNA استفاده كنيم .

4 - آزمايش هايي كه پادتن ميكروب عامل بيماري را در شير جستجو مي كنند :

به نظر مي رسد كه واكنش هاي ايمني وابسته به سلول ، اولين و مهمترين پاسخ حيوانات به آلودگي است . روش طولاني مدت اندازه گيري واكنش پاسخ ايمني سلولي ، انجام آزمايش پوستي است كه عبارتست از تزريق مقادير كمي از عصاره مايكوباكتري در زير پوست و مشاهده واكنش آماسي و قرمز شدن محل تزريق ، پس از 2 تا 3 روز . حساسيت آزمايش تشخيصي پوستي بيماري يون در حدود 54 درصد و اختصاصيت آن حدود 79 درصد مي باشد . ميزان تخميني اين آزمايش ، كمتر از آزمايش كشت مدفوع و يا الايزا است . يكي از روش هاي مهم آزمايشگاهي ديگر براي تشخيص پاسخ سلولي به مايكوباكتري ها ، سنجش ميزان گاما اينترفرون است . اين آزمايش بر روي نمونه هاي خوني انجام مي شود و در آن ميزان آزاد سازي تركيبات شيميايي خاصي به نام گاما اينترفرون اندازه گيري مي شود . مشكل اين روش اين است كه نمونه هاي خوني گرفته شده را بايد ظرف 6 تا 12 ساعت پس از خون گيري به آزمايشگاه برد تا گلبول هاي سفيد حتماً زنده مانده باشند . براي سنجش ميزان دقت اين روش ها ، بررسي هاي كمي صورت گرفته است . اين آزمايش ها مي توانند حيواناتي كه در مرحله 2 و يا بالاتر آلودگي باشند را شناسايي كند . حساسيت و اختصاصيت اين روش مشخص نيست .